Práctica nº 11
Tinción de hongos con azul lactofenol
Objetivo
Preparar la muestra a partir de un alimento que contenga hongos para poder estudiar la estructura de aquel microorganismo.
Examinar el aspecto microscópico y macroscópico de la morfología talófica. A partir de de la tinción de con azul de lactofenol con el método de la cámara húmeda.
Introducción
El análisis de la calidad de los alimentos incluye la determinación de los hongos que se encuentran en los alimentos, cuando se degradan.
Los hongos pertenecen al grupo de eucariota en este están las levaduras, mohos y setas.
Los hongos deuteromicotos con los conidios y conidioforos no tienen ningún tipo de protección.
El taló de un hongo esta formado por hifas (són filamentos cilíndricos constituidos, generalmente están ramificadas) y estas estás estan divididas por septas. Y el conjunto de hifas se le llama micelio.
La reproducción asexual de los hongos tiene a lugar en las esporas, que se encuentran en las extremidades de las hifas. Estas esporas tiene una estructura como las uvas.
Las esporas axesuales de los hongos se pueden formar de varios tipos;
Clamidiòporas
Conidiosporas
Los hongos se encuentran de manera asexual y sexual. Y las floriduras que desarrollan encima de los alimentos, pertenecen al grupo; Deuteromicetos, es una subdivisión artificial(reproducción asexual).
La tinción con azul de lactofenol de la pared externa de las estructuras taloficas, se realizan en una sola etapa.
Material
Alimento podrido (tomate, naranja)
Solución de azul de lactofenol
Cultivo en una placa de petri (TSA)
Portaobjetos
Cubreobjetos
Microscopio óptico
Nansa de picadura
Aceite de inmersión
Bec Bunsen
Agua salina fisiológica
Procedimiento
Para poder observar los hongos en el microscopio óptico, sin tener ningún tipo de error es aconsejable;
Limpiar el portaobjetos con la disolución éter etílico (v/v).
Secarlo con el papel, hasta que este totalmente seco, y no tenga nada de éter, ya que es un alcohol y puede eliminar las bacterias existentes.
Se coloca una gota de agua salina fisiológica encima del portaobjetos. Y con la ayuda de la Nansa de picadura esterilizada en el Bec Bunsen se pica un trocito de hongo de la naranja podrida y se expanden por encima de la gota de agua salina fisiológica, hasta que no se seque. O sino se deja al aire libre para que el portaobjetos se seque.
Después de que se seque la muestra, se coge una gota de azul de lactofenol con una aguja estéril y se añade encima de la muestra. Es aconsejable esperar un par de minutos, después de introducir el reactivo .
Il·lustració : azul de lactofenol
Se cubre la muestra con el cubreobjetos y esta preparación ya esta lista para poder ser observado en el microscopio óptico. Hay que intentar que no queden burbujas de aire en la preparación, ya que sino lo que se observara mayoritariamente serán las burbujas.
Antes de coger el microscopio óptico hay tener en cuenta que depende de como se coja el instrumento se pueden estropear las lentes ópticas, ya que al coger bruscamente se pueden desviar de su origen.
Con la ayuda de las pinzas se coloca la muestra. Y se centra la muestra con la ayuda del condensador.
Sobretodo tener en cuenta que en el principio de todo para observar las estructuras se usa una resolución de 4X. Después de encontrar el microorganismo, se puede ir aumentando hasta llegar a la resolución más grande. Para poder ver bien el microorganismo.
Resultados
La disolución que se utiliza para limpiar el portaobjetos, que esta constituida por etanol y éter etílico tiene una concentración del 50%
(1:1; v/v).
Lo cual quiere decir; que en los 100mL de disolución se encuentra dos volúmenes diferentes con la misma concentración.
En la primera muestra que se había querido analizar, los hongos que contenía la naranja, en esta se han observado; muchas burbujas de aire.
Dibuix 1: floridura verde de color verde que contiene la naranja
Aunque también se ha podido observar pequeñas hifas insignificantes. Lo cual quiere decir que esta primera prueba no se a analizado bien, ya que en el procedimeineto ha habido algún tipo de error.
En la segunda muestra se analizado, las floriduras que contenía el tomate.
En el centro de del portaobjetos se puede observar: la muestra que se observa es de color azul y amarillo oscuro.
En la parte de la izquierda y en la derecha se pueden observar diversas hifas septadas y en las extramidades se pueden observar conidios.
Abajo a la derecha se puede observar en el extremo de las hifas se puede observar un par de conidios rodeado de esporas.
Dibuix 2: floriduras de color verde que contiene el tómate
El objetivo corto de una resolución de 4X aumento, de un microscopio óptico, también se le conoce como objetivo de escombrado.
El azul de lactofenol, a partir de este reactivo se puede observar el moho aislado, gracias al fenol que destruye la flora acompañante, el ácido láctico que conserva las estructuras fungicidas.
La composición que tiene el reactivo azul de lactofenol es la siguiente;
Fenol......0,1gr
Ácido láctico...8mL
Agua destilada..1mL
Glicerina.......... 20mL
Azul de anilina.....0,5gr
Las floriduras que pueden aparecer en un alimento como en la naranja, los géneros Aspergillus y Penicillium.
| Gènero | Aspergillus | Penicillium |
| Familía | Trichocomaceae | |
| Orden | Eurotiales | |
| Clase | Eurotiomycetes | |
| Filo | Ascomycota | |
| Reino | Fungi | |
Taula 1: Grupo taxonómico
El micelio son el conjunto de filamentos que constituye el talo de los hongos.
El conjunto de todos los filamentos que constituye el talo de un hongo se les llama hifas y el conjunto de hifas se le llama micelio.
El conidio también conocido como conidioespora. Se encuentran en el extremo de las hifas. La caracteristica que tiene es que tiene una produccion asexual de miles de esporas llamadas esporas.
El microscopio simple es aquel que utiliza tan solo una lente de aumento, en cambio, el microscopio compuesto es aquel que se utiliza más de una lente de objetivo. Hoy en dia se utiliza más el microscopio compuesto ya que asín se puede observar con diferentes resoluciones, ya que se utilizan para examinar microorganismo transparente, que no se pueden observar a simple vista.
En la primera muestra que se ha observado (floriduras de la naranja) no se han observado septos.
En la segunda muestra (floriduras del tómate) que se ha estudiado se han podido examinar las hifas septadas en el hongo.
Discusión
La disolución que se emplea para limpiar el portaobjetos debe de tener la misma concentración para no estropear el portaobjetos, y posteriormente secarlo muy bien hasta que se seque totalmente, ya que sino los resultados no serán adientes o directamente no aparecerán ningún tipo de bacteria.
Tan solo colocar un trocito del hongo del alimento ya que si no aparecerán muchos microorganismo y no se podrá observar bien los micelios.
Dejar unos minutos en el aire la preparación después de añadir el reactivo ya que si se cubre directamente se quedaran burbujas y no se podrá observar adecuadamente la muestra.
Para observar en el microscopio óptico es recomendable introducir una gota de aceite de inmersión para poder observar mejor la observación.
Conclusión
En definitiva para poder lograr ha hacer una buena práctica es aconsejable no introducri una gran cantidad tanto de agua salina fisiológica y el reactivo azul de láctofenol, ya que puede producir dificultades en la observación de los hongos.
Dejar la preparación en el aire libre durante unos minutos para no dejar ningún tipo de burbujas.
Introducir una gotita de aceite de inmersión ya que ayudrá a ver la muestra.
Empezar a observar la muestra con la resolución más pequeña y luego pasar a a resolución más grande.
