Práctica nº8
Recuento de los bacterias aerobias masofilos en una muestra de alimentos;
técnica de sembrar en superficies
Objetivo
Dominar correctamente el método; banco de diluciones, para poder obtener disoluciones de concentración continuamente inferior a la solución inicial.
Emplear el procedimiento en la placa para hacer el recuento viable de las bacterias aerobias masofilos.
Introducción
En el laboratorio de microbiologia alimentaria, tiene una gran importancia el banco de diluciones. Para poder valorar los microbios mesófilos, que, contiene la muestra inicial.
El recuento de bacterias aerobias mesófilos permite conocer la calidad sanitaria de los productos alimentarios.
El objetivo que tiene este método, hacer una valoración de la microbiota bacteriana masófila, sin poder especificar el tipo de bacterio que hay en la muestra inicial;
El recuento de un numero bajo de bacterias aerobias mesófilos no asegura que la muestra no este contaminada.
El recuento de un numero elevado de bacterias aerobias mesofilas, asegura la presencia de microbios patogenos.
Los bacterios mesófilos són microorganismos;
Aerobio; organismos que necesitan O2 para poder desarrollarse.
Anaerobio facultativo; pueden usar el O2 si está presente.
Hetretrofos
Masófilos, permiten crecer en un intervalo de una temperatura (22º y 44ºC).
Las bacterias crecen en un medio de cultivo sólido de tipo agar;
Plate Count Agar (PCA)
Trypticase Soy Agar (TSA)
Agar Nutritiu (AN)
Para poder hacer el recuento de las bacterias aerobio totales que hay en una muestra de alimentos, hay que emulsionar lo varias veces, posteriormente, sembrar en una placa de Petri con un medio de cultivo solido.
El recuento de bacterias aerobias masófilas totales se realiza de tal modo que hace falta incubar las placas de Petri sembradas a una temperatura de 37ºC , y también hay que sembrar una muestra del alimento a la misma temperatura.
El recuento elevado de bacterias masófilas en un alimento puede ser debido a una o varias de las siguientes causas;
Elaboración incorrecta durante la elaboración de los alimentos.
Condiciones inadecuadas del tiempo o temperatura durante el almacenamiento.
Alteración inmediata de los alimentos.
Posibilidad que pueda haber bacterias patógenos.
Que las primeras materias estén excesivamente contaminadas.
Según el grado de contaminación de la muestra que se quiere analizar, muchas veces es necesario hacer diluciones de la muestra original, para poder hacer un banco de diluciones.
Las diluciones de la muestra se hacen de una manera decimal (1/10) y ordenada.
Material
Muestra de alimentos, leche desnatada y leche entera
Bec Bunsen
Rotulador
Vortex
Gradilla
Tubos y tapón
Micropipetas( 0,1mL-1mL) y puntas estériles
Nansa de Kolle
Estufas bacteriológicas
Solución fisiológica salina (solución Ringer ¼)
Agitador-
Para poder preparar el medio de cultivo se necesita;
Autoclave
Placas de Petri
Medio de cultivo (AN, TSA)
Agitador-escafador
Vas de precipitats
Aigua destil·lada
Cinta adhesiva de esterilidad
Balança analítica
Botella de pirex
Espatula
Vidrio de reloj
Barilla de vidrio
Procedimiento
Para poder realizar el método de, banco de diluciones, el primer paso es preparar el medio de cultivo.
Anteriormente en la práctica nº3 se enseñó a preparar un medio de cultivo (AN, TSA).
El primer passo se prepara; el banco de diluciones
Dejar todo el material que se ha nombrado anteriormente, en la mesa de trabajo.
Agitar moderadamente el tetra brik (para homogenizar el contenido), que contiene la muestra (leche entera) que previamente se analizará.
Rotular los tubos con el factor de diluciones; 100 ,10-1, 10-2, 10-3,10-4, 10-5
Inocular, en condiciones estériles, en un tubo de ensayo esterilizado, un volumen de 9 ml de la muestra de la leche desnatada o la leche entera.
Coger 1mL, de la leche entera, con una micropipeta, en un tubo que contenga 9mL de dilucion, en el tubo que este marcado 10-1,
Agitar bien el tubo con el vórtex, posteriormente se coge 1mL de disolucion de este tubo, y se añade en el tubo 10-2.
Esta operación se hace sucesivamente.
Segundo paso ; sembrar y incubación;
Preparar el medio de cultivo TSA, colocar-lo en las placas de petro estéril (20mL) y dejar solidificar el medio, con las tapas encerradas.
Escribir en la parte posterior de la placa de Petri con el rotulador permanente;
Nombre
Medio de cultivo
mL de dilución que contiene la placa de Petri (ej;10-1, 10-2...)
Nombre del pruducto alimentario.
Temperatura
Derramar 0,1mL de la muestra que se analizara, leche entera, en las placas que contiene el medio de cultivo. Se sembrara en cinco dilucines decimales contiguas del producto que se analizara(leche entera o desnatada) se incubaran a 37ºC.
Con la ayuda de la nansa de Digralsky estéril, se distribuirá el inoculo por toda la superficie de la placa de Petri, que contiene el medio, hasta que la dilución quede absorbida totalmente por la muestra.
Incubar (en la estufa )las placas sembradas , en posición invertida(para no humedecer el medio):
- Las placas de Petri deberán de estar incubadas a 37ºC durante 48 horas.
Tercer paso; contar las colonias y describirlas;
Después de que transcurra el tiempo estimado, de la incubación de las placas de Petr.
Se contará el numero total de colonias crecidas durante este periodo.
Para poder hacer el recuento de colonias, hay que tener en cuenta;
Se han de coger placas que contengan entre 30–300 colonias, para poder calcular posteriormente la mediana aritmética.
Entonces hay que calcular el recuento de cada dilucion, el resultado sera la mediana de los valores obtenidos.
| Factor de dilucion | Numero ufc(37ºC) | ufc/mL(37ºC) |
| 1:100 | >300 | 3X105 |
| 1:10-1 | 181 | 1,8X104 |
| 1:10-2 | 20 | 2X104 |
| 1:10-3 | 4 | -------- |
| 1:10-4 | 2 | -------- |
| 1:10-5 | 3 | -------- |
Taula 1: Unidades formadoras de colonia a partir de la sembra de las diluciones de la muestra de alimentos, leche entera.
Cuando no se encuentran colonias en el medio de cultivo coresponde a una dilucion más concentrada, el recuento apreciado se expresa como inferior a uno multiplicado por el factor más concentrado.
Resultados
Se puede observar en las placa de Petri con el factor de dilución 100.
Se observan más de 300 colonias, mayoritariamente las colonias son de color blanco, aunque también se presentan algunas colonias de color amarillo. Casi todas las colonias son; coccos y diplococcos con una forma irregular, además están elevadas de forma cóncava, y presentan una olor muy fuerte.
En la placa de Petri con el factor de dilución 10-1.
Estás colonias una olor más tolerable respecto a la anterior muestra. Aquí también se puede observar que casi todas las colonias son de color blanco
excepto un par que son amarillas, estan elevadasde forma concava.
Las demás placas de Petri con los factores de dilucion; 10-2, 10-3, 10-4, 10-5 .
Las mínimas colonias que se presentan en estas placas, con un color amarillento,estas
presentan un olor más aguantable respecto a las otras dos.
El agua fisiológica que que se utiliza para preparar el banco de diluciones, es una solución isotonica de cloruro sódico al 0,9%=0,900g.
Es una solución para perfusión intravenosa, apirógeno.
Las bacterias hetretrofas utilizan como fuente de energia, de la materia organica de los seres vivos.
Los bacterios mesofilos aerobios (BAM) son microorganismos que necesitan O2 para desarrollar sus funciones vitales.
La Unidad Formadora de Colonias(UFC) es el valor que indica el grado de contamincaión microbiologica que contiene el medio ambiente. Expresa un numero relativo de microorganismos de un taxón determinado en un volumen.
El recuento de las colonias;
| Factor de dilucion | Numero ufc(37ºC) | ufc/mL(37ºC) |
| 1:100 | 300 | 3X105 |
| 1:10-1 | 181 | 1,8X104 |
| 1:10-2 | 20 | 2X104 |
| 1:10-3 | 4 | -------- |
| 1:10-4 | 2 | -------- |
| 1:10-5 | 3 | -------- |
Taula 2: Unidades formadoras de colonia a partir de la sembra de las diluciones de la muestra de alimentos. Leche entera
Bacteris/mL
B1=181UFC x 1 x 1 = 18100UFC/mL=1,8x104 .
0,1mL 10-1
B2=20UFC x 1 x 1 = 2x104 UFC/mL
0,1mL 10-2
Mediana aritmética
1,8x104 + 2x104 UFC/mL =3,8x104 UFC/mL
B1+B2/2 = 3,8x104 UFC/mL=1,9x104UFC/mL
2
Numero de bacterios aerobios totales(48h 37ºC); 1,9x104ufc/mL
Discuión
La leche cruda o la leche sin pasteurizar, se realiza un control de la calidad. Entre otros se observa el nivel de microorganismos patógenos que se encuentra en esa determinada leche.
Una leche apta, para que un consumidor pueda tomar no puede sobrepasar a los 105 UFC/mL, para que sea consumible.
En esta práctica se puede observar que los resultados no han tenido unos valores grandes ya que en el factor de dilucion de:10-3,-4,-5 no ha tenido un gran nombre de unidad formadora de colonias en una temperatura de 37ºC, respecto a la resta de factores de dilucion, ya que estas contienen más UFC/mL a la misma temperatura.
Se puede observar que hay una gran diferencia en estos valores ya que hay placas que; contiene más de trescientas colonias y otras que no contiene más de una colonia.
Una de las causas podría ser :
En las tres ultimas placas de Petri, no se hayan efectuado el procedimiento que se había comentado en la ultima clase.
Realizar el trabajo en condiciones no estériles.
No coger la dilucion del tubo que se marcado.
No agitar bien el tubo en el vórtex.....
Conclusión
Se podría llegar a la conclusión que esta práctica no se ha desarrollado correctamente ya que hay una gran diferencia en estos valores.
Aunque si observamos la mediana aritmética de esta leche entera (1,9x104ufc/mL incubado 48h en 37ºC) ya que una leche apta para consumir debe de tener menos de 105 , para que se pueda tomar.
Bibliográfia
Apuntes de clase
