Práctica nº12 (segunda parte)
Confirmación de la presencia de
S.Aureus en los alimentos
Objetivo
Determinar la asistencia o ausencia en cinco pruebas diferentes, en donde se encuentran enzimas de catalasa, Dnassa .
En una colonia sospechosa de ser S.aureus procedentes de una muestra en una colonia de un cultivo puro de S.aureus y otra de S.epidermis.
Introducción
La catalasa (CAT) és un enzima que se encuentra en organismos vivos (en las celulas de los tejidos animales y vegetales) y cataliza la descomposición del peróxido de hidrógeno (H2O2) en oxigeno (O2) y en agua (H2O) y se aliebra burbujas de gas y H2O;
H2O(aq) O2 + ½ H2 O2
El H2O2 es uno de los productos finales del metabolismo oxidativo aerobico de los glúcidos. Si se deja amontonar una gran proporción de H2O2 se manifiesta muy tóxico .
La enzima coagulasa elaborada por el S.aureus encima del fibrinogeno, modificandolo en fibrina. La reacción tiene a lugar si en el medio no hay calcio (Ca+2) y esto se aconsigué por que el reactivo lo contiene, también, el reactivo anticoagulante EDTA, que lo inhibe (agente quelante).
La enzima Desoxirribonucleasa (DNA-assa) està producido y liberado en el medio gracias al bacterio S.aureus. Es un enzima capaz de hidrolizar el ADN.
Material
Agua oxigenada | Agua destilada | Nansa de Kolle |
Bec Bunsen | Portaobjetos | Pipeta Pasteur |
Taula 1: prueva de la catalas
Jeringa | Plasma de conejo |
Socas puras | Hisopo |
Taula 2: Prueba lenta de la coagula en el tubo
Nansa de Kolle | Agua detilada | Placas de petrio | HCl | Agar DNassa | Espátula |
Botella de Pirex | Balanza | Vaso precipitado | Bec Bunsen |
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Taula 3: prueba de la DNassa
Procedimiento
Prueba de la catalasa
Portaobjetos 1
Coger, con la ayuda de la nansa de Kolle esterilizada de la colonia pura de S.aureus del medio de cultivo agar sangre (AG).
Posteriormente extenderla en el portaobjetos y distribuir una gota de H2O2 30%. Resuspender la colonia enzima de este.
Portaobjetos 2
Repetir el procedimiento cogiendo una colonia sospechosa a S.aureus en el medio de cultivo Manitol Salt Agar (MSA) procendetne de un cultivo homogeneizado del tomate.
Portaobjetos 3
Volver ha hacer la prueba con socas puras de S.epidermis crecidas en el medio de cultivo AG.
Y finalmente hacer la lectura de la reacción teniendo en cuenta que el resultado será (dejar reacciónar durante 20-30”);
Positivo; aparecen burbujas de gas encima de la muestra, la presencia de pequeñas burbujas no quiere decir que el resultado sea positivo.
Negativo, no aparece nada.
Prueba lenta de la coagulasa en el tubo
Se ha de reconstruir el plasma de conejo con con serúm fisiológico. Con la ayuda de una jeringa estéril se añadirán 0,4 mL de solución fisiológica estéril en un tubo estéril y posteriormente se introducirán 0,5 mL plasma de conejo .
Tubo 1
Se introducen 0,5 mL de agua fisiológica y se suspende la colonia de la soca pura de S.aureus y posteriormente se añade 0,5mL de plasma de conejo.
Tubo 2
Se vuelve a hacer el mismo procedimiento peró con una soca pura de S.epidermidis.
Incubar los tubos a 37ºC ly observar os resultados a cada 1, 2, 4, 8, 16,24 horas. Hay que tener en cuenta que esta practica se ha realizado un viernes y durante dos días no se podrá sacar de la incubadora las muestras ni ver los resultados y hay un gran riesgo de que si se incuban más de 24 horas las muestras se producirá fibrinolisis, se deshará el coagulo que a dado positivo en la coagulosa lenta y este hecho nos puede dar resultados erróneos aunque en un inicial no sea de tal modo.
Prueba de la DNAas
Suspender 20 gramos de medio en un litro de agua destilada. Hervirlo encima del calentador-agitador durante un par de minutos hasta homogeneizar la disolución. Y posteriormente esterilizar en el autoclave durante un cuarto de hora a 121ºC .
Luego comprobar el pH del medio (7,3). Y distribuir 18 mL del medio en las placas y esperar a que se solidifique este medio.
Placa 1
Con la ayuda de la nansa de Kolle, previamente esterilizada con la llama del Bec Bunsen, sembrar colonias de soca pura, S.aureus, realizando tan solo una estriá en la superficie del medio, ya que posteriormente se bañara con la solución de HCl.
Para poder comparar esta muestra, se hará el mismo procedimiento con una soca pura de S.epidermis.
Placa 2
Se vuelve ha hacer la misma prueba con una soca pura de S.epidermidis para que posteriormente se compararan los resultados.
Se hará otra vez la misma práctica con microorganismos sospechosos a ser S.aureus medio de cultivo de MSA procedentes del medio de BP (Baird Parker) originarios del tomate, nariz y las uñas.
Se incubara las placas de petri a 37ºC durante 24 horas.
Después de que trasncurà el tiempo adiente se banya el medio con HCl. Y para ello hay que preparar la disolución.
Hay que preparar la disolución observando la etiqueta que tiene el HCl para poder añadir en el medio de cultivo de una disolución de 100 mL
Dibuix 1: composicon en litros y kilos
En el vaso precipitado se introducirían 8,78mL de ácido clorhídrico con la ayuda de una pipeta y la resto se introducir de agua destilada. Y estará listo para poder bañar el medio .
Gracias a HCl precipita el fragmento de Dnasa y por este motivo se forma un halo claro , transparente alrededor del crecimiento bacteriano. En cambio da negativo si el medio es opaco y no se ha formado el halo.
Resultados
En cada ensayo tiene una distinta solución e incluso con socas puras de distinto genero en un misma prueba tiene una diferente terminación.
Prueba de la catalasa
Microorganismos estudiados
S.aureus (socas puras) positivo
S.epidermis (socas puras) positivo
S.aureus (socas puras) negativo no se había realizado el trabajo con el procedimiento adecuado.
En las dos primeros portaobjetos se han formado burbujas al introducir una gotita de agua oxigenada, y por lo tanto se puede decir que las colonias que se ha mostrado son positivas en la presencia de del enzima catalasa.
Prueba lenta de la coagulassa
Microorganismos estudiados
S.aureus (socas puras) positivo (resultados de otra compañera ya que al resto del grupo ha sido negativo)
Ha primera vista parece un gel de color transparente peró en realidad tinen un estado sólido.
S.epidermis (socas puras) negativo
En el fondo del tubo hay una pequeña parte que parece ser que se ha formado una pequeñísima cantidad de coagulo pero no es asín.
Puede ser que estos resultados no se han del todo correcto ya que los tubos han estado en la incubadora más de 24 horas, han estado aproximadamente unas 48horas en la incubadora, y ha podido producirse el proceso de fibrinolisis (degradación de la fibrina).
Se considera que el resultado a dado positivo cuando el coágulo pasa de un estado de liquido a sólido. A partir de la fibrina atrapa las proteínas y otras sustancias.
Prueba de la Dnasa
Microorganismos estudiados
S.aureus (socas puras) positivo
S.epidermis (socas puras) negativo
Medio de cultivo MSA nariz (procedentes del medio de BP) positivo
Medio de cultivo MSA uñas (procedentes del medio de BP) negativo
Medio de cultivo MSA tomate (procedentes del medio de BP) negativo
La composición de este medio de Dnasa es ;
Tryptosa 20g/l
DNA 2g/l
cloruro de sodio 15g/l
agar 15g/l
El pH final del medio de cultivo debe de ser aproximadamente de 7,3 más o menos 0,2.
Después de sacar las placas de petrio se ha podido observar una única estriá con microorganismos ,que se hizó el último día.
Después de la introducción de HCL se ha observado que las placas de petrio que han dado positivo se ha formado un halo, y los que no el medio se ha obsevado que el medio es opaco.
Prueba bioquímica | S.aureus | S.epidermis | MSA nariz | MSA Uñas | MSA tomate |
Catalasa | + | - | (no se a realizado ) | (no se a realizado ) | (no se a realizado ) |
Coagulasa lenta | + | - | (no se a realizado ) | (no se a realizado ) | (no se a realizado ) |
Coagulasa rapida |
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DNassa | + | - | + | - | - |
Discusión
En estas prácticas es muy sencillo tener resultados erróneos ya que en algunas ocasiones no se han tenido las condiciones adecuadas para poder realizar este trabajo.
Prueba de la catalasa
Procurar de no quemar las bacterias, ya que cuando se esteriliza la nansa de kolle con el be bunse tiene una temperatura adecuada para poder matar estas bacterias.
Homogeneizar el tubo para que se encuentre en toda la disolución los microorganismos, con la ayuda de vórtex.
Prueba lenta de la coagualasa
Obsevar cada x tiempo durante las 24 horas no dejar pasar de este tiempo ya que sino puede producirse fibrinolisis descomposición de las redes de fibrina.
Hacer el trabajo en la lamina de flujo ya que es muy sencillo de contaminar la muestra.
Prueba de la Dnasa
Solo se debé de hacer una estria en la placa de petrio ya que posteriormente se tiene que introducir HCl y pueden dar resultados erróneos, por la cantidad excesiva de bacterias que se pueden observar y no se puede diferenciar.
Una vez que se introduzca HCl en el medio de cultivo no se puede utilizar para otras prácticas ya que con este ácido se mueren todos los microorganismos y no se presentaran ningún tipo de bacterio.
El contacto directo o indirecto puede afectar las mucosas humana ya que es un producto muy acidifico e incluso puede producir quemaduras.
Conclusiones
En general hay tener en cuenta de que las condiciones del sitio de trabajo deben de ser condiciones estériles ya que sino se puede estropear las muestras de la practica.
Después de esterilizar la nansa de kolle refriar el medio donde no se encuentre ningún bacteria para no matar estos.
No dejar que pase más tiempo de lo prolongado ya que si no puede tener efectos contrario a los esperados.
Observar en la botella del ácido la etiqueta, para poder calcular la cantidad necesaria para poder preparar esta disolución, con los cálculos necesarios para sumergir en el medio esta disolución.
Bibliografia
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