1.Objectius
Identificar la forma i el tipus de paret dels microorganismes d'una colònia separada a través de de la tinció de gram
2.Introducció
Hans Christian Gram (Copenhague, 1853-1938) fou un microbiòleg i metge danès, que va va desenvolupar la tinció de Gram a Copenhague, va ser professor de patologia i terapèutica a la universitat de Copenhague.
Gràcies al progres d'aquesta investigació permet diferenciar la forma cel·lular dels bacteris, a més es el primer pas per a la diferenciació bacteriana , on es poden classificar un parell de grups amb significat taxonòmic depenen de la seva resposta;
Gramnegatiu; són bacteris que no reten el cristall de violeta en la tinció de Gram, i per tan manifesten el color rosat. Majoritàriament dels bacteris són patogènics.
A més presenten un parell de membranes lipídiques amb una paret cel·lular de peptidoglicà i aquest es el motiu que reté el colorant, i a més són molt absorbents a la solució decolorant.
Grampositiu; bacteris què retenen el cristall violeta durant el procés de tinció Gram, aquesta característica esta lligada a l'estructura de la envoltura cel·lular, per tant refleja un tipus natural d'organització bacteriana.
Diverses especies bacterianes poden presentar alhora cèl·lules de Gramnegatiu i Grampositiu.
A més emprar cultius antics pot donar respostes inadequades, i aquest fet pot causar un excessiu agrupament de les cèl·lules.
Material
Portaobjectes
Microscopi
Oli d'immersió
Pipetes Pasteur
Guants
Solució salina fisiològica
Encenedor
Bec Bunsen
Paper secant especial
Alcohol d'acetona
Solució de lugol
Aigua
Blau Violeta
Safrina
Nansa de Kolle
Fucsina
Xeringa
Gradeta
Procediment
Per poder fer aquesta practica em de tenir a la taula de feina tots els materials que posteriorment s'han anomenat.
Posar el paper secant especial a sobre de la taula de feina. El primer pas es, netejar els portaobjectes amb aigua i sabó i després amb alcohol perquè quedi desengreixat, s'ha d'eixugar fins que no quedi humitat.
Al portaobjectes s'ha de posar el propi nom a la zona esmerilada per saber durant el protocol de la tinció, quina és la part superior i quina l'inferior.
Un cop esterilitzat la nansa de Kolle amb el bec Bunsen s'agafa una colònia de la placa de petri què prèviament s'havia mostrejat, la cantonada de la paret de microbiologia.
És col·loca a sobre del portaobjectes una gota de la solució fisiològica salina, ja què facilita el desenvolupament, amb l'ajuda d'una xeringa, em de tenir en compte que la gota de la solució no ha de ser ni gran ni petita, ha de tenir un tamany més o menys mitjà. A sobre de la superfície del portaobjectes en la zona què havíem dipositat la petita quantitat de la solució fisiològica salina dispersarem la colònia amb un moviment circulatori. El material què s'ha col·locat en el portaobjectes és deixà què és sequi al aire lliure o bé és fixa el material amb la calor de la flama posant-lo varies vegades per la zona blava de la flama del bec Bunsen , fins que el vidre estigui tan calent què molesti al tacte, però que no quemi.
Es col·loca el portaobjectes en el suport de tinció per a què es refredi el portaobjectes i torni a estar a la seva temperatura ambient.
Un cop fixada la cèl·lula a sobre del portaobjectes es tenyeixen;
Primer es cobreix la preparació amb una solució de cristall violeta i es deixa en repòs durant un minut, i després es renten per poder treure l'excés de colorant.
En aquest estat, totes les cèl·lules, tant com les grampositives com les gramnegatives, estan tenyides de color blau.
Es duu a terme després la decoloració, es renta la preparació amb aigua, però s'ha de tenir en compta que l'aigua que ha de caure l'aigua a sobre la part superior de làmina, que no conte la mostra.
Es cobreix el portaobjectes amb la solució lugol ( solució de iode molecular) i deixar-ho en repòs durant un minut. Aquesta solució actua com mordent i intensificant per a retenir el colorant cristall violeta, el iode penetra en les cèl·lules i forma un complex insoluble en les solucions aquoses amb cristall violeta. Forma un compost insoluble amb el colorant i determina la seva fixació de les bateries.
Tornar a rentar l'excés de colorant amb aigua inclinant lleugerament el portaobjectes.
Passat el minut d'haver actuat el mordent, el frotis es decolora amb alcohol-acetona, (7:3 v/v) daurant 15 o 30 segons, tot i que si la tinció prèvia no ha estat gaire intensa el temps ha de ser inferior o bé s'endurà el colorant blau de les grampositiu, segui amb la mateixa solució fins que no s'escuri més liquid blau, movent el portaobjectes suaument. Amb aquesta solució decolora els microorganismes que no tenen fixat el colorant cristall de violeta , que surt a través del porus de la paret bacteriana.
Es torna a decantar el portaobjectes i rentar el frotis amb aigua per treure el decolorant, inclinat el portaobjectes, i esperea que s'eixugui el portaobjectes.
Un cop assecat el portaobjectes, procedim a tenyir novament però aquesta vegada amb safirina, cobrir amb solució de fucsina i deixar-lo actuar durant un minut. Aquest colorant tenyeix de color vermell-rosat, els microorganismes que no havien sigut capaços de retenir el colorant cristall- violeta, pot ser que tenyeixin de color vermell rosat.
Passat el minut corresponent, es precedeix a esbandir el portaobjectes amb aigua, i es deixa per assecar en l'aire lliure.
De manera , ja tindrem preparat el frotis per poder observar-ho en el microscopi.
Un cop fet tot aquests procediments ja està disposat la preparació per poder observar-ho, a 1000 augments amb l'objectiu d'immersió, però primer l'observarem amb sense col·locar l'oli d'immersió per poder comprovar la diferencià que es pot observar durant l'observació. Un cop visualitzat sense oli, li afegirem a la mostra una goteta d'oli d'immersió, i ens adonarem gracies al oli d'immersió s'eliminen casi completament la desviació dels raig de la llum i augmenta considerablement la eficaica del objectiu del microscopi.
Resultats i discussió
Segons quina sigui la finalitat s'empara una tinció determinada, així podem parlar de ;
Tinció simple, és un mètode què s'utilitzà un sol tipus de colorant.
Tinció composta, és un mode d'emparar més d'un colorant.
Tinció diferencial, tincions que s'usen per diferenciar de manera més explicita els microorganismes.
Les tincions de gram negatiu són aquells bacteris què no es tenyeixen de color blau o violeta, i ho fa d'un color rosat, aquesta característica està lligada a la estructura de l'embolcall cel·lular, i no reflexa el tipus natural del bacteri. Els bacteris de gram positiu són els bacteris que retenen el cristall violeta durant el procés de tinció gram.
La tinció de Gram són per a diversos tipus de cèl·lules de composició química diferent, i per recció desigual en front a una tinció, estan constituïdes per dues etapes;
Tinció primària (tinció si mple)
Tinció de contrast s'aplica un altre colorant , revelen les cèl·lules no tenyides.
La solució de Lugol és una dissolució de iode molecular i iodur potàssic en aigua destil·lada, aquesta dissolució s'utilitza com a antisèptic i desinfectant. És emprat en la tinció de Gram per retenir el colorant cristall violeta, el I2 penetra en les cèl·lules i forma un complex insoluble en solució aquosa.
Moltes espècies de bacteries de gramnegatiu causen patologies: Els cocs causen la gonorrea (Neisseria gonorrhoeae), meningitis ( Neisseria miningitidis).
Entre els bacteris de grampositiu que causen patologies en trobem; Enterococcus( patologia urinària orgànica), Staphylococcus auerus (contaminació urinària per via hematogenea).
Es col·loca una gota de solució fisiològica salina per poder diluir la colònia que esta damunt del portaobjectes el que volem estendre la colònia.
Al final quan s'ha observat en el microscopi s'ha pogut comprovar que els bacteris estaven tenyits de color blau, per la tinció gram que previament s'ha fet, això vol dir què la pared cel·lular composta per una gruixuda capa de peptidoglicà.
S'ha han pogut observar coccus, que tenen una forma esfèrica que apareixen aïllats i dispersos en la divisió cel·lular. També s'ha pogut observar diplococcus, tenen una forma esfèrica que apareixen per parells. A més a més s'ha pogut observar unes cadenes llargues, anomenades Estreptococcus.
També s'han pogut observar bacteris de forma irregular.
Aquesta observació s'ha fet en el microscopi a 160/0,17.
6.Conclusions
S'ha de tenir en comte alhora de fer la preparació ja que si el portaobjectes no està net pot provocar que el resultat final no sigui correcte.
A més a més s'ha de tenir en compte que la solució fisiològica salina sigui una gota no massa gran, ja que trigara més en assecar . També esta alerta quan s'esta donant calor de la flama del bec Bunsen no apropar-se molt ja que es molt cremar amb molta facilitat la preparació, i llavors s'hauria de tornar de fer el procediment des del començament.
Alhora de treure l'excés de colorant amb aigua és aconsellable que caigui l'aigua a sobre la part superior de làmina que no conte la mostra, així conservem la mostra de no espatllar la mostra.
Es aconsellable col·locar una goteta d'oli d'immersió, gracies a aquest oli es pot observar els microorganismes amb més claredat.
7.Bibliografia
Apunts de classe
http://www.microinmuno.qb.fcen.uba.ar/SeminarioTinciones.htm
aquesta pagina explica les formes què es poden trobar en una tinció grampositiu.
