Determinación de la presencia de Staphylococcus aureus
en alimentos y en la mucosa humana
Objetivo
Determinar la existencia o la inexistencia de Staphylococcus aureus en las mucosas nasales, en las uñas y en la oreja, en un individuo.
Dominar perfectamente el modo de empleo de un medio, conocer la cantidad que se introduce en una placa de petri estériles
Hacer la resiembra de una colonia.
Introducción
Staphylococcus aureus es una bacteria anaerobia (no utilizan oxigeno) grampositiva elaboradora de la coagulasa y catalasa.
Es un microorganismos unicelular, sin núcleo. Tiene una forma de coco de unos 0,8-1,0 mm de diámetro, y se agrupan en forma de uvas. Son inmóviles de y no tienen esporas.
Además son muy sensibles a la calor y de los desinfectantes.
La carencia de higiene en los alimentos puede ser una causa de la existencia de las toxinas liberadas por este microorganismo. Y esto manifiesta una intoxicación alimentaria que son ingeridas en los productos alimentarios.
Una mala manipulación de los alimentos genera una elevada presencia de estafilococos. Si además los estafilococos están separados en cepas enterotoxigenicas, supone un riesgo elevado para la salud.
El medio de cultivo Manitol Salt Agar (MSA), también llamado Champan. Es un medio de cultivo de crecimiento bacteria, ja que es selectivo para los microorganismos halófilos, y a la vez se puede diferenciar entre los estafilococo patogénicos y no patogénicos.
Es un medio selectivo y diferencial para excluir y inhibir el desarrollo de determinadas bacterias, por tal de evitar que compitan entre ellos , y determinar la capacidad metabólica del microorganismo.
El medio de cultivo Agar Sang (AG), permite el crecimiento de un amplio rango de microorganismos, además permite reconocer los microorganismos que hacen un encima hemolisina los eritrocitos de la sangre de un animal.
Material
Nansa de Kolle y de Digralski
Tubos de plástico
Agua destilada
Botella de vidrio de Pirex
Medio de cultivo; mas, AS
Pipetas Pasteur de plástico estériles
Bolsa de stomacher estériles
Placas de Petrio gruessas
Estufa de cultivo
Bec Bunsen
Rotulador negro(con punta fina)
Vórtex
Pipetas automáticas, con puntas de plástico estériles
Autoclave
Jarra de anaerobiosis
Reactivo que consuma el oxigeno
Procedimiento
Retirar la bolsas del stomacher, que se diluyo la muestra de alimento, de la nevera (es donde se ha mantenido durante estos días) para evitar que continúe creciendo el cultivo.
Primera parte; Preparación del medio de cultivo MSA
Disolver ciento once gramos por litro de agua destilada, mezclar calentándolo durante un par de minutos. Esterilizar el medio de cultivo en el autoclave a ciento veintiún grados durante un cuarto de hora.
Retirar de la nevera la botella de pirex que contiene el medio de cultivo APT.
Segunda parte; Resembrar
Fundir en el microondas, el medio de cultivo AN que esta en la nevera y emplacarlo en las placas de petri, veinte militros.
Con un hisopo estéril, se humedece con la solución salina fisiológica, se recoge una muestra de las uñas, oreja y de la cavidad nasal.
Con la nansa de Kolle esterilizada en el Bec Bunsen se coge una colonia sospechosa que corresponda a un estafilococo de aquellas que se habían guardado en la nevera y en las que se habían sembrado con un hisopo, las muestras de uñas....
Hacer una dilución 1/10 de la bolsa de stomcacher; pipetear, con la pipeta automática con puntas estériles, un mililitro de la bolsa en un tubo de plástico y añadirle nueve mililitros de APT.
Agitar el tubo que contiene la dilución con el agitador.
Incubar todas estas colonias a treinta y siete grados.
Tercera parte; Sembrar
Distribuir con la ayuda de la nansa de Kolle, por agotamiento, en la placa de petrio de cultivo con medio agar sang, con una colonia de S.aureus que lo dará el profesor.
Abrir la jarra de aneorobios, previamente abierto el reactivo en el interior y la placa de petrio con medio agar sang, en la que se ha sembrado S.aureus. Y cerrrar la jarra.
Incubar la jarra de aneorobios en la estufa a treinta y siete grados y también y el resto de las placas de petrio, con la tapa hacia abajo por tal de evitar que se condense el vapor de agua encima del medio de cultivo.
El método PNT tan solo permite determinar la presencia o ausencia de S.aureus en las muestras de los alimentos y no sirve para realizar ningún tipo de recuento.
Cuarta parte; Resultado
Leer el resultado del crecimiento probable de estafilococo en el medio de cultivo mas y hacer el recuento.
Resultado
La dilución de cultivo enriquecido en la bolsa de stomacher se hace para dar vida a los microorganismos.
El medio de cultivo mas, es un medio de cultivo selectivo para los microorganismos, S.aureus.
El medio de cultivo MSA crecen determinados tipos de bacterias gracias a estos nutrientes;
Extracto de carne
Pluripeptona, constituyen la fuente de O2 ,N2, vitaminas y minerales.
El medio de cultivo MSA, es un medio solido de aislamiento directo.
La composición que tiene el medio agar sangre es;
Infusión de músculo de corazón......375,0g/l
Peptona.....10,0g/l
Cloruro de sodio…..5,0g/l
Agar …..15,0g/l
El compuesto químico indicador del pH que contiene este medio es el rojo fenol.
El medio que se encuentra inicialmente es de color rojo, y posteriormente cambia el color amarillo, en función de que el valor de pH de medio de cultivo sea de 7,4 + -.
El medio de cultivo de agar sang, es un medio de cultivo solido.
Las colonias crecidas en el medio de cultivo mas, fermentan el manitol y se visualizan como colonias amarillas rodeadas de una zona del mismo color.
Las colonias que han crecido en el medio de cultivo MSA, a la concentración 10-1 a 37ºC durante cinco días(desde el veinticinco de febrero hasta el treinta de febrero).
Se puede observar que han crecido bacterias de color amarillo con una forma ovalada, parecen bastante viscosas, tienen un tamaño mediano, aunque hay alguna colonia que se esta desarrollando. Se puede observar unas quince colonias. Además este medio a dado positivo ya que las colonias que han crecido son de color amarillo.
Las colonias que han crecido en el medio de cultivo MSA, a la concentración 10-2 a 37ºC durante el mismo periodo.
Este medio también da positivo ya las colonias son de color amarillo, aunque han crecido menos colonias que la anterior, ya que la concentración es inferior a la anterior.
Tiene unas ocho colonias más o menos de un tamaño mediana, ovaladas, y presentan mucha viscosidad.
Respecto a la resta de la muestra hay muestras que presentan mucho peligro y hay otras que no presentan tanto peligro;
Yogur +
Tomate +++
Xampiñones ++
Mandarina +
Se puede observar según el resultado de estas muestras que el producto alimentario más peligroso es el tomate, ya que es el que más S.aureus presenta.
Se puede observar que el medio de cultivo de SA, ha pasado de rojo a marrón, el halo se ha formado en todo el perímetro, ya que en toda la superficie se presenta el S.aureus, en forma de zig-zag. Esta muestra era de una uñas de un individuo.
En la colonias de S.aureus en un medio de cultivo agar sang, forman un halo,( es un circulo blanco rodeado de las bacterias.
El S.aureus hacen una ß-hemolisis completa (desintegración de los hematíes con liberación de hemoglobina).
Discusión
Al manipular alimentos con una insuficiente higiene puede provocar una intoxicación alimentaria.
No sobrepasar con el tiempo, para fundir el medio de cultivo ya que sino puede derramarse e incluso se puede petar y estropear el instrumento y el medio.
Humedecer el hisopo, con agua salina fisiológica, para poder coger con más facilidad la muestra, ya que si no es más dificultoso coger la muestra del lugar apreciado.
No lavarse las manos que se pretende estudiar ya que si no, “no se podrán observa los microorganismos”.
Hay que pipetear con la pipeta automática diez veces, 0,1mL, ya que que no tenemos una pipeta con un volumen más amplio.
Sembrar con la ayuda de la nansa de kolle en forma de zigzag para que no se apelotonen los microorganismos, y se puedan observar bien estas bacterias.
Si el indicador rojo de fenol no cambia de color, eso quiere decir, que no se ha hecho el trabajo con un correcto funcionamiento.
Hay que diluir 0,1mL de la bolsa de stomacher que había triturado el tomate en la disolución.
Para que el medio de cultivo de MSA de positivo las colonias crecidas deben de ser de color amarillo, y si no es asín en ese medio no han aparecido bacterias de S.aureus, eso no quiere decir que no haya aparecido otros tipos de bacterias
Para que el medio de cultivo de SA de positivo el medio debe de cambiar de color pasa de ser el medio de cultivo de color rojo a amarillo, y se forma un halo al rededor del bacterio. Aunque se puede observar que en esta muestra el medio a cambiado de rojo a marrón, sigue dando positivo, ya que la bacteria que se a formado es muy grande.
Conclusión
Manipular los alimentos en una zona limpia ya que si no provocar una intoxicación alimentaria.
No pasarse de los cinco minutos, a la hora de fundir el medio de cultivo, ya que sino puede pasar lo que antes se ha comentado.
Humedecer el hisopo para facilitar la recogida de la muestra.
No lavarse las manos, para poder observar los microorganismos.
En el medio de cultivo SA de positivo si el medio ha cambiado de color y en el bacterio se ha formado un halo. Para los S.aureus.
En el medio de cultivo de MSA si la bacteria que se ha formado es de color amarillo, eso quiere decir que el S.aureu están presentes
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